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產(chǎn)品展示
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TOPO-TA/Blunt Simple Lightning Cloning Kit-

  • 型   號:42212
  • 價   格:
  • 更新時間:2025-04-23
  • 廠家性質(zhì):經(jīng)銷商

可在室溫條件下,20分鐘完成TA克隆或Blunt克隆,陽性率接近100%,并且免冰浴、免熱激、免藍(lán)白斑篩選,還可以連接長達(dá)10kb的DNA片段。
TOPO-TA/Blunt Simple Lightning Cloning Kit-

TOPO-TA Blunt Simple Lightning Cloning Kit


TOPO-TA/Blunt Simple Lightning Cloning Kit-

目錄號42212

產(chǎn)品內(nèi)容:

產(chǎn)品成份

42212-20 (20 rxn)

42212-80(80 rxn)

pTOPO-TA/Blunt Vector (30ng/ul)

40 ul

160 ul

1000bp Control (30ng/ul)

5 ul

5 ul

10x Enhancer

20 ul

20 ul

保存條件:

-20℃,存放 12 個月,不影響使用效果。

產(chǎn)品簡介:

可在室溫條件下,20分鐘完成TA克隆或Blunt克隆,陽性率接近100%,并且免冰浴、免熱激、免藍(lán)白斑篩選,還可以連接長達(dá)10kb的DNA片段。

克隆步驟(≤3kb 片段)                 簡化步驟(≤10kb 片段 免復(fù)蘇,免液體 LB

1、連接:室溫 5 分鐘;                        1、連接: 37℃連接 5 min。

2、轉(zhuǎn)化:室溫 5 分鐘;                        2、轉(zhuǎn)化:冰浴 5 min,42℃熱激 1 min,冰上 2 min

3、復(fù)蘇:180rpm、37℃振蕩培養(yǎng) 10 分鐘;涂板。 3、取全部菌液涂板,37℃倒置培養(yǎng)。

操作步驟:

1.         PCR 產(chǎn)物的制備:

a.       引物要求:引物不能磷酸化。

b.     酶的選擇:根據(jù)需要選擇DNA 聚合酶,該載體兼容PCR 產(chǎn)物的A 末端和平末端。

c.        電泳檢測 PCR 產(chǎn)物的量和質(zhì)量:

①僅有目的條帶,可直接進(jìn)行連接反應(yīng),無需純化;

②如果有多條帶,建議凝膠回收 DNA 片段(DC011-100);

③如果以質(zhì)粒為模板的擴增,則必須進(jìn)行凝膠回收,因為模板質(zhì)粒也會長出非目的菌落。

2.         連接反應(yīng):

1) 室溫(20℃-37℃)建立連接體系(10ul 體系):

純化后的 PCR 產(chǎn)物

0.5-5 ul

pTOPO-TA/blunt Vector

2 ul

10 ? Enhancer

1 ul

滅菌水

X ul

總體積

10 ul

不同大小插入片段的推薦用量:

插入片段大?。╞p)

最佳用量(ng)

100-1000

10-40

1000-2000

40-80

2000-5000

80-180

加完試劑后,輕彈管底混勻(或輕輕吹打混勻,點甩離心收集所有液體在離心管底。

2) 室溫(20℃-37℃)連接 5 分鐘。連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,或置于冰上備用。

3.         轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇、涂板:

1)100ul 感受態(tài)細(xì)胞,置于室溫解凍(約 1 分鐘左右),輕撣幾次將細(xì)胞均勻懸浮。

2)     加入 10ul 連接液,輕輕混勻,室溫(20℃-37℃)放置 5 分鐘。

3)      加入 500ul 平衡至室溫的 LB 或者 SOC 培養(yǎng)基(不含抗生素),37℃ 180 rpm 振蕩培養(yǎng) 10 min

注意:大于 3kb 的片段,振蕩培養(yǎng)時間延長至 30-60 分鐘,可以增加轉(zhuǎn)化子?;蛘哂煤喕襟E

4)        取 200?l 菌液涂板(含氨芐青霉su 50-100ug/ml),培養(yǎng)過夜。(為得到較多克隆,4000 rpm 離心 1 min,吸棄掉部分上清,保留 100-150ul,輕彈懸浮菌體,取全部菌液涂板)

注意:如果使用 5ul 體系,各成分按照比例減半,使用次數(shù)可以加倍。

4.         轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定:

本制品陽性率相當(dāng)高,一般情況下,可以達(dá)到所見即所得,只要是長出來的菌落正常(不是污染的雜菌,轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少,基本就包含插入。因此插入片段不超過 2-3kb 的情況下可以不用鑒定直接挑 1-2 個菌去測序。

1)  菌落 PCR 檢測:挑單菌落于 10ul 無菌水中,混勻,取 1ul 置于 25ul PCR 體系,用 PCR 引物或者M(jìn)13 通用引物去鑒定陽性克隆。

2)用通用 M13F(-20)/M13R(-26)引物測序來確定是否含有目的克隆。


TOPO-TA/Blunt Simple Lightning Cloning Kit-

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